Фукоидан для лечения остеопороза
Введение
Взаимосвязь между остеобластами и остеокластами определяет процессы образования и резорбции костей. С возрастом преобладают процессы резорбции кости и возрастает возможность механического их повреждения в результате остеопороза (Frost 1992). Остеопороз является серьезной проблемой пожилых лиц и способствует их смерти, физической нестабильности, нарушения качества жизни и требует применения синтетических препаратов. Лекарства обычно тормозят потерю кости, но не способствуют процессам их образования. В большинстве случаев лекарственные препараты вызывают боли в животе, страх (Segal et al. 2003) и повышают риск развития рака груди (Genant et al. 1989). Процесс новообразования кости регулируют остеобласты. Поэтому соединения, влияющие на их функцию, могут способствовать снижению остеопороза. Ранее проведенные исследования показали, что сульфатированные полисахариды, включая фукоидан, гепарин и цитозан-хондроитин сульфат влияют на остеогенез (Park et al. 2011; Santo et al. 2012; Takada et al. 2003). Эти полисахариды оказывают положительное влияние на дифференцировку и регенерацию кости.
Недавно показано что фукоидан, 30 kDa, оказывает больший потенцирующий эффект на костеообразование (Changotade et al. 2008). Однако при этом не оценивалось влияние фукоидана ( 1 kDa) на процессы дифференцировки кости. Проведено два вида исследований: 1) влияние на пролиферацию и дифференцировку 7F2 остеоластов in vitro; 2) влияние на образование кости in vivo на линии стареющих мышей.
Влияние НМ и обычного фукоидана на выживаемость клеток
Фукоиданы за счет полианионной структуры связываются с белками, влияя на биоактивность. Однако это зависит от мол.веса (Shimizu et al. 2005). НМ фукоидан в дозе 2мг/мл и обычный повышают выживаемость клеток на 150.33 ± 6.50 % и 130.12 ± 5.74 %, соответственно (Fig. 1).
Эти результаты согласуются с данными на влияние НМ фукоидана на пролиферацию остеобластов и усиление биоактивности (Changotade et al. 2008). Zhang et al. (2011) также показали, что НМ 500 Da фукоидан быстрее абсорбируется сосудистой стенкой (Zhang et al. 2011). Дифференцировка остеобластов проходит три стадии: первая пролиферация клеток; вторая включение в матрикс и третья минерализация. В первую фазу включаются ряд экстраклеточных белков, таких как: прогологен I, трансформирующий фактор роста бета (TGF)-β, и фибронектин. Вторая фаза характеризуется экспрессией щелочной фосфатазы (ЩФ). Для третьей фазы важна экспрессия ряда белков остеокальцин, салопротеин кости и остеопонтин (Kasperk et al. 1995). Ранее сообщалось о том, что фукоидан увеличивает пролиферацию 7F2 клеток и повышал дифференцировку остеобластов, здесь мы исследовали ЩФ и остеокальцин, как маркеры второй и третьей фаз соответственно. ЩФ важный компонент образования кости, и ее увеличение способствует местному повышению фосфора, минерализации протомера и снижению концентрации экстраклеточного пирофосфата (ингибитора минерализации) (Golub and Boesze-Battaglia 2007). Отмечалось увеличение активности фермента до 135.35 % при даче 2 mg/ml (Fig. 2).
Также оценивалось влияние фукоидана на секрецию остеокальцина. Остеокальцин способствует росту кристалла, который способствует образованию кристалла гидроксиапатита (Boskey et al. 1998). Как показано на Fig. 3, фукоидан повышал в 7F2 клетках секрецию остеокальцина в дозо-зависимой манере. При окраске 7F2 клеток Alizarine Red-S staining assay in cells. LMW fucoidan (0.25–2 mg/ml) significantly наблюдается благоприятное влияние фукоидана на количество гидроксиапатита в дозо-зависимой манере (Fig. 4). Фукоидан из Undaria pinnatifida также увеличивал активность ЩФ, секрецию остеокальцина и величину минерализации (Cho et al. 2009). Более того, >30 kDa фукоидан стимулирует дифференцировку остеогенеза клетками человека (Park et al. 2011), а 30 kDa фукоидан повышал пролиферацию остеобластов, активность ЩФ, секрецию остеокальцина и минерализацию (Changotade et al. 2008).
Очень мелкий фукоидан 4.5 kDa, также повышает остеогенную активность стромальными клетками человека (Pereira et al. 2013). Нами показано, что и обычный фукоидан увеличивал активность ЩФ, секрецию остеокальцина, пролиферацию клеток и минерализацию матрикса в процессе остеогенной дифференцировки Остеогенез комплексный процесс включающий дифференцировку остеобласта и далее включение его на белковый матрикс кости (Lian et al. 2004). Для выяснения влияния фукоидана на минерализацию оценивалась экспрессия маркеров дифференцировки остеобласта в культуре 7F2 клеток. BMPs группа факторов роста известная под названием цитокины и метабологены, которые стимулируют дифференцировку остеобластов посредством экспрессии ЩФ и остеокальцина (Xiao et al. 2004). Наши данные свидетельствуют, что экспрессия BMP-2 увеличивалась в 2.28 раз при даче фукоидана в концентрации 2 mg/ml). В экстраклеточном матриксе кости содержится коллаген (COL I), который составляет 90 % органического матрикса кости (Boskey et al. 1999) и есть также неколлагеновые белки, такой как BSP (Bianco et al. 1991). НМ фукоидан увеличивал мРНК COL I (Fig. 5d), но не COL II, и стимулировал экспрессию мРНК BSP в 7F2 клетках (Fig. 5e). Подобный эффект отмечен также Cho et al. (2009), Changotade et al. (2008) и Park et al. (2011) показавших увеличение уровня COL I в остеобластах. Остеонектин является гликопротеином в кости, который связывает кальций, гидроксиапатит и COL I. Он секретируется остеобластом в процессе образования кости и иницирует минирализацию и образование минерального кристалла (Bellahcene and Castronovo 1995). Экспрессия уровня мРНК остеонектина увеличивалась в 1.74 раз при даче НМ фукоидана в дозе 2 mg/ml (Fig. 5f). Мы показали, что НМ фукоидан усиливает in vitro остеогенную дифференцировку 7F2 клеток, способствуя увеличению пролиферации, активности ЩФ, минерализации экстраклеточного матрикса, и экспрессии остеобластических генов. Для выяснения влияния НМ фукоидана in vivo его давали перорально стареющим самкам в течение 4 недель. Масса тела при этом достоверно не менялась. Отмечалось некоторое повышение плотности кости при введении только карбоната кальция 100 mg/kg BW (Table 3). Известно, что абсорбция кальция падает у лиц 60-80 лет из-за плохого питания (Bullamore et al. 1970) что снижает транспорт кальция (Armbrecht et al. 1979). Ежедневный прием кальция при этом не способен улучшить образование кости у пожилых лиц, тогда как отмечалось увеличение плотности кости при приеме кальция с 280 mg/kg фукоидана (Table 3). Sargassum horneri экстракт стимулировал образование кости in vitro (Uchiyama and Yamaguchi 2002b) и in vivo (Uchiyama and Yamaguchi 2003), и оказывал анаболический эффект на компоненты кости молодых и старых крыс (Uchiyama and Yamaguchi 2002a). Более того, отмечалось увеличение абсорбции кальция в кишечнике, и повышение плотности кости (Fujita et al.2000).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключении можно сказать, что мы показали, как под влиянием фукоидана отмечается стимуляцию остеогенной дифференцировки in vitro, и повышение анаболического эффекта на минерализацию кости in vivo. Это указывает на то, что использование Низкомалекуляррного фукоидана будет препятствовать потери кости с возрастом и повышению ее плотности.
